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超聲波破碎細胞的常見問題

更新時間：2010-01-19 點擊次數(shù)：4844次

大腸桿菌表達外源蛋白，在超聲破碎的時候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較

好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些細菌同樣起作用，比如鏈霉菌。

細菌沉淀直接加樣品1buffer，再加5ul的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步

驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min（下次適當(dāng)補點醋酸即可）,將染色液換成大量的水（自來水即

可）在微波爐煮10min 就可以。

在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會就產(chǎn)生大量泡沫，影響

了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，zui后都是破碎不*，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。

1*會產(chǎn)生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭一定要接近底部，約1cm（我一般是距底部0.5mm）。功

率根據(jù)儀器不同會有所不同，但你可以觀察液面，有波動但不要太劇烈就好。

2*破3S停10S，破個二三十次看看。

3*變幅桿位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。在破碎時

試著加大體積,強度不要超過60%.

4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說，你的方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，停頓時間稍長一

些，這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

鏈霉菌（放線菌）超聲破碎的，用的方法條件是什么？

前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。

使用超聲破碎時采用的具體條件是：

（1）取細菌的24 h培養(yǎng)液于5 000 r／min 下離心5 min收集菌體．

（2）用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液．置于40

mL大塑料試管內(nèi)．

（3）將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎（功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S）．

（4）破碎液于12 000 r／min下高速冷凍離心30 min，收集細胞碎片和上清夜．

超聲破菌流程與上述基本一致，就是洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl，洗滌一次就

可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加終

濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強度和次數(shù)，有必要隨時鏡檢觀察菌體是否*破碎。

放線菌屬于原核生物系統(tǒng)進化樹上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的革蘭氏陽性菌

（Eubacteria）分枝類群，它雖然具有原核生物*的分子生物學(xué)特性，但在其不同類群中，細胞壁的化學(xué)

組分變化很大。

在做大腸桿菌超聲時，采用的是400W，超5停5的方法，效果不錯，但是用在鏈霉菌上，似乎沒什么效

果。會不會就是由于細胞壁組成差異造成的呢，因為大腸桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。

再有鏡檢是檢驗破碎效果,但是細胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關(guān)系嗎？破碎時間長也會影響到

酶的活性。所以想問問anaisai戰(zhàn)友，你提供的“功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S”的條

件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的，也可以用于發(fā)酵離心后的菌泥嗎？如果可以，你破碎的全程時間大概是多

少呢？

如果你需要的是胞內(nèi)酶，細胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關(guān)系。破碎時間長的確會影響到

酶的活性。這就需要在*的破碎時間和酶活性之間做出判斷，zui直接的辦法是先繪制相關(guān)曲線（酶活性和

時間的關(guān)系曲線）。

實驗中，破碎的是棒狀桿菌（也是很難破壁的G+菌），破碎時間控制在30min左右，酶活較好。

如果是基質(zhì)菌絲的話,好可以考慮用溶菌酶處理一下.

一般來講這幾種方法讀可以的:

一,液氮研磨

二,用french press破碎

三，超聲波破碎

四，溶菌酶處理預(yù)處理

超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機械波，它既是一種波動形式,又是一種能量形式。超聲對細胞的作用主要

有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機械效應(yīng)。熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動，

使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱（42－43℃）。空化效應(yīng)是在超聲照射下，生物體內(nèi)形成空泡，隨著空泡震動和

其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機械剪切壓力和動蕩。另外，空化泡破裂時產(chǎn)生瞬時高溫（約5000℃）、高壓（可達

500×104Pa），可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應(yīng)

可導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過氧化和細胞殺傷。機械效應(yīng)是超聲的原發(fā)效應(yīng)，超聲波在傳播過程中介

質(zhì)質(zhì)點交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細胞結(jié)構(gòu)損傷。損傷作用的強弱與超聲的頻率和強度密切相

關(guān)。

拌，發(fā)現(xiàn)菌液發(fā)粘，菌體不能夠很好分散，用高壓勻質(zhì)機破碎，加壓后，菌液不能進入勻質(zhì)機，速度很慢，

請問是何原因？能有好的辦法解決，很好用勻質(zhì)機快速破碎菌體？

將破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大。超聲處理5－10分鐘，菌液粘度即可大大降低，也可促進

菌體分散。

不同型號的設(shè)備功率不一樣，功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍（直徑2mm至幾十毫米），你使

用多大的變幅桿就在設(shè)備的上調(diào)至該刻度（很簡單的）！變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm，5～

50ml可選6～8mm，50ml以上選10mm的變幅桿，依此類推！占空比不用關(guān)心的，主要是指超聲時間和停

頓時間的比值。

酵母破碎的問題

一般的PROTOCOL都是用glass beads 破碎酵母細胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做過的方

法中還是玻璃珠，效率很高，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應(yīng)該用這個方法。

化學(xué)裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的

加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值

8.0），據(jù)說效果可以。

畢氏酵母細胞破碎法

在破碎遇到的問題是菌體濃度太低，OD620nm在4-6之間。細胞破碎儀的zui低破碎體積為4ml左右，這

樣再稀釋一倍，OD就到2-3啦，我們懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測定時會測不準。所以請教大家細胞破碎時

zui低的菌濃多少為下限？我們的菌是一種棒桿菌。破碎后，你可將液體放入透析袋中濃縮。

我們所做的方法是按照1：20的比例將離心后的菌體（e.coli）溶解于超聲緩沖液（50mM 磷酸 pH

8.0 ）300w 10s/10s 破碎20分鐘。做了鏡檢！基本全被破碎了！我做蛋白純化的，做的包涵體。實驗中

我們的菌體濃度相對獨立，與培養(yǎng)液中的菌體od無關(guān)，不收其限制，便于操作者調(diào)控。

一般按每g濕菌體加5-10ml裂菌緩沖液。

超聲肯定會產(chǎn)熱，所以一定要有降溫裝置，除非你需要得成分耐高溫。

100g大腸桿菌溶于1L破碎液里（破碎掖：50mM Tris-Cl（PH8.5） 5mM EDTA 0.14M NaCl），攪

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